本研究通過組織培養,對葉下珠進行芽的誘導、增殖、生根和煉苗移栽等,建立了一套完整的葉下珠組培快繁體系,為葉下珠大規模繁殖提供技術參考。
葉下珠組培方法
1、培養條件
基本培養基為 MS,瓊脂 7.5 g·L-1,蔗糖為 30 g·L-1,pH 5.8~6.0。培養溫度(25 ± 1) ℃,光照時間12 h·d -1,光照強度1000~1500 lx。
2、外植體接種
選取長勢均勻的葉下珠植株,用剪刀剪取位于植株中部的莖段,去除葉片與假葉柄。加1~2滴洗潔精將莖段表面洗刷干凈,流水沖洗5~6 h。于超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 s,然后用0.1%升汞消毒13 min,無菌水沖洗5~6次,并用無菌濾紙擦干,置于接種盤上。用手術刀將外植體切成1.5~2 cm帶節莖段,生物學頂端朝上接種于培養基上。
3、生長調節劑配比試驗
將消毒外植體接種到按單因素多水平設計的不同生長調節劑配比的、添加0.5 g·L-1活性炭的MS培養基中,共計7組,分別為:IBA為0.2 mg·L-1,6-BA分別為1.0、1.5、2.0、3.0 mg·L-1;6-BA 為 1.5 mg·L-1,IBA 分別為 0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1 。每組 15 瓶,每瓶接 1個外植體,每3 d觀察1次,15 d統計誘導情況。
4、誘導培養基 得出芽誘導佳生長調節劑配方后,對比添加0.5 g·L-1活性炭的MS和1/2MS培養基的誘導效果,共2組,每組24瓶,每瓶接1個外植體,每4 d觀察1次,20 d后統計誘導情況。
5、不同濃度6-BA對葉下珠芽的處理
將莖段誘導出的芽在超凈工作臺上切成1.5~2 cm帶芽莖段,接種至添加不同濃度6-BA的培養基中,共計3組,每處理5瓶,每瓶2個,即每處理10個外植體,每5 d觀察1次,25 d后統計芽增殖情況。
6、不同濃度NAA與IBA對叢生芽的處理
將增殖擴繁的叢生芽在超凈工作臺上分成單個芽,接種至添加蔗糖20 g·L-1的不同培養基中,共計6組,每處理5瓶,每瓶10個芽,即每處理50個芽,每5 d觀察1次,25 d后統計生根、長勢情況。
7、煉苗
將生根的瓶苗轉移至培養室外進行煉苗,處理時間設置見表5。煉苗后清水洗凈根部培養基,移栽至加水拌成泥狀的菜園土基質。栽培條件:自然光,氣溫25~30 ℃。移栽15 d后統計成活率。
葉下珠的主要藥理活性成分柯里拉京是一種多酚類物質,極容易氧化。在外植體誘導叢生芽的過程中,莖節的切口會分泌大量次生代謝產物,導致外植體褐化,降低組培成功率。外植體褐化程度高,需通過多次轉接以避免褐化,但是多次轉接易造成污染。本試驗通過添加活性炭以吸收次生代謝物,抑制褐化效果良好,也減少人為操作帶來的污染。
在芽增殖試驗中,1.0 mg·L-1 6-BA 和0.2 mg·L-1 IBA的生長調節劑組合是較適合芽增殖的生長調節劑配比,但他們認為芽增殖中6-BA佳濃度為2.0 mg·L-1。本研究中6-BA濃度為1.0、1.5、2.0 mg·L-1的芽增殖系數均達3倍以上,并以1.0 mg·L-1時增殖倍數大,小芽長勢好。
在煉苗移栽研究中,基質為泥狀菜園土。泥狀土在栽培初期水分飽滿,但后期易結塊,對組培苗成活率造成一定影響??蛇m當添加一定比例的有機土進行改良,調整土壤疏松度,以利于移栽苗成活。
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